Fotobiyolojik cilt tedavisinin iyileştirici etkisi , üzerinde yıllarca yapılan tıbbi araştırmaların sonucu ile kanıtlanmıştır. Restorelite cihazı , insanın en büyük organı olan cildimizin daha genç ve daha sağlıklı olmasını sağlayan , ameliyatsız ve iğnesiz , güneş ışınlarındada bulunan doğal bir ışın türünü cilt ve kırışık tedavisinde nihai kullanıcıya sunan tek cihazdır.

Göz ile görünmeyen bu doğal ışın , 1072 nm dalga boyunda çalışarak sağlığınıza hiç bir zarar vermeden istediğiniz sıklıkta kullanma olanağını sağlar. Muntazam kullanımında cilt hücrelerindeki kolajen ve elastanlar uyarıldığından cildiniz hiç bir yan eti olmaksızın gençleşecektir.

İnsan lenfositleri üzerinde  IR1072 ve IR880 kızılötesi ışık kaynaklarının farklı etkilerinin araştırılması: IR1072 ile selektif sitoproteksiyon kanıtları

 Andrea Bradford a, Amelia Barlow a,b, Paul L. Chazot a,*

 a - School of Biological and Biomedical Sciences, University of Durham, South Road, Durham, Tyne & Wear DH1 3LE, İngiltere
b - School of Pharmacy, University of Sunderland, Wharncliffe Road, Sunderland, Tyne & Wear SR2 3SD, İngiltere

Alındığı taril 9 Marü 2005; revize edilmiş olarak alındığı tarih 24 Mayıs 2005; onay tarihi 24 Mayıs 2005

Abstrakt

Lazer ve LED ışık tedavilerinin birçok tedavi arenasında klinik yarar sağladıkları gösterilmiştir. IR1072 ve IR880’nin fitohemaglütininle stimüle edilmiş taze hazırlanmış insan lenfositleri üzerindeki etkileri geniş bir tek ve çoğul irradyaslon protokolleri kullanılarak araştırılmıştır. Beş günlük bir dönemde günde bir defa irradyasyonu takiben, canlı hücre sayıları IR1072 ile irradyasyondan sonra, uygulama yapılmayan kontrollere göre anlamlı ölçüde yüksek kalırken IR880 radyasyonundan sonra anlamlı ölçüde düşüktür. Tek başına UVA uygulanan hücrelere göre, IR1072 uygulandıktan sonra UVA’ya maruz bırakılan örneklerde hücre sayıları anlamlı daha yüksektir. Çeşitli dalga bantlarıyla 3. Günde iki defa ışınlanan hücrelerde 5. Günde IR1072’den sonra ve IR1268 irradyasyonuyla dönüşümlü olarak IR1072’den sonra canlı hücre yüzdesinde bir artış oluken tek başına IR880 irradyasyonuyla canlı hücre yüzdesinde bir azalma olmuştur. Ayrıca, test edilen dalga bantlarında kontrol ile karşılaştırıldığında anlamlı farklar görülmemiştir. IR1072 ve IR880 uygulamalaından sonra 3. Günde ve 5. Günde toplanan hücrelerde antiiNOS antikoru ile sondajlanan kantitatif immunoblotting kullanılarak protein düzeyleri karşılaştırılmıştır.

IR1072’yi takiben iNOS proteini ekspresyonu uygulamadan sonra 5. Günde kontrollerle karşılaştırıldığında

4.9 ± 2.1 kat yüksek iken IR880 uygulamasında böyle bir yükselme olmamıştır.

 _ 2005 Elsevier B.V. Bütün hakları saklıdır.

 Anahtar sözcükler: 1072 nm; 880 nm; UVA; PHA Blastlar; Sitoproteksiyon; iNOS; Apoptoz

 1011-1344/$ - see front matter _ 2005 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.jphotobiol.2005.05.005

* Yazışma için yazar. Tel.: +44 191 334 1305; fax: +44 191 334 1201.

E-posta adresi: paul.chazot@durham.ac.uk (P.L. Chazot).

Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 81 (2005) 9–14

www.elsevier.com/locate/jphotobiol

 BASIMDAKİ MAKALE

 1. Giriş

Güneş ışığı Dünya’daki yaşam için temel öneme sahip iyonizan olmayan radyasyonun en önemli ve evrensel kaynağıdır. Bitkiler ve hayvanlar evrimsel olarak güneş ışığının atmosfer tarafından süzülerek gezegenin yüzeyine ulaşan bu güneş ışığı bileşenlerine uyum sağlamışlardır.

  Suyun iletim spektrumuyla ışığın fotobiyoloik etkilerinin karşılaştırılması bunların tümünün bu spektrumun piki içinde mevcut olduğunu göstermiş olup bu, atmosferdeki veya hücre içindeki suyun evrimsel süreçlerin gidişini belirlemede etkili olabildiğini düşündürmektedir (Şek. 1)

Güneşin ultraviyole (UV) kısa dalgalı yüksek enerjili radyasyonunun hücrele zarar verdiği ve ışığa bağlı yaşlanma ve karsinogenezden sorumlu olduğu bilinmektedir [1,2]. Buna karşılık IR’nin (kızılötesi, infrared) yararlı bir tedavi ajanı olduğu, örneğin kas iskelet hastalılarının tedavisinde ve yaraların iyileşmesinde faydalı olduğu bilinmektedir [3,4]. Çoğu lazer ışık kaynaklarının ticari kullanımıyla ilgili olsa da laboratuarda, kızılötesi ışığın çeşitli foto biyolojik etkileri araştırılmıştır [5–10]. Bu iyi belgelenmiş deneyler seçilmiş dalga boylarına sahip kızılötesi ışığın termal olmayan foto biyoloik etkisinin olduğunu kuşkuya yer bırakmayacak şekilde göstermiştir. 1998’de Menezes et al. [2] IR ışığın (700–2000 nm) termal olmayan miktarlarının normal insan fibroblastlarında solar UV toksisitesine karşı güçlü bir hücresel savunmayı uyardığını göstermiştir. 2001’de , Dougal ve Kelly [11] 1072-nm’lik dar dalga bandının bir defa 5 dakikalık uygulanmasının herpes labialis tedavisinde etkili olduğunu göstermiştir. Su molekülünün transmisyon spektrumunda bir piki temsil ettiğinden ötürü 1072-nm’lik ışık seçilmiştir. Uçuğun (herpes labialis) bağışıklık savunma sistemini baskıladığı bilinen UV tarafından aktive edildiği bilinmektedir [12].

  Küçük, kısa ömürlü reaktif nitrik oksit molekülü (NO) güçlü bir apoptoz inhibitörüdür. Apoptozun NO tarafından inhibisyonu B-lenfositleri [13], splenositler [14] ve endotel  [15] hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücrelerde gösterilmiştir. Nitrik oksit (NO) moleküler oksijen ve L-arginin arasında enzimle katalizlenen bir reaksion sonucunda oluşmaktadır. NO çok sayıda fizyoloik ve patofizyolojik sürece aracılık eden önemli bir moleküldür. NO üretiminin miktarı [16] onun rolünü ve hasarın tipini belirleyebilir [17]. Amino asit sekanslarının ortalama %50’si özdeş olan üç nitrik oksit sentetaz (NOS) formu tanımlanmıştır [18]. Nitrik oksit sentetazın indüklenebilir izoformu (iNOS) tarafından türetilen NO inflamatuar bir üründür.

iNOS ile endotel NOS (eNOS) ve nöronal NOS (nNOS) arasında fark vardır. eNOS ve nNOS aktivitesi için kalsiyum gerekli iken iNOS’a kalmodulin bağlanması çok sıkı olduğundan Ca2+ ilavesine gerek yoktur [19]. iNOS ekspresyonu uyarana bağlı olarak çeşitli hücre tiplerinde yukarı regüle olabilir [20–22] veya aşağı regüle olabilir [20].

Bu çalışma, eğer varsa bir dizi dar ışık dalga bandı serisinin insan lenfositleri üzerindeki etkisini  araştırmak için tasarlanmış olup bu hücrelerin yakın kızılötesi spektrumu içindeki ışığa karşı olası foto biyolojik yanıtını ve in vitro olarak kızılötesi ışık uygulamasından sonra iNOS ekspresyonu üzerindeki etkileri belirlemeyi amaçlamaktadır.

2. Gereç ve Yöntem

2.1 Hücrelerin hazırlanması

    Sağlıklı gönüllülerden (yerel etik komite onayı ile) heparinize insan tam kanı alınmış ve periferik kanın mononükleer hücreleri (PBMC) Lymphoprep (Axis-Shield Poc AS, Oslo, Norveç) kullanılarak ayrılmış ve 5 dakika süreyle 400 g gücünde santrifüje tabi tutulmuştur. PBMC’ler arada kalan tabakadan izole edilerek iki defa RPMI’de L-glutamin olmadan (Gibco™) yıkanmış ve RPMIcm (RPMI+%10 v/v fetal buzağı serumu + %1 penisilin/streptomisin + %1 L-glutamin) içinde yeniden süspansiyon hazırlanmıştır. Hücre dansitesi RPMI ile 1x10⁶ hücre/ml olacak şekilde ayarlanmıştır. 100 ml PHA (‘Lektin’, Sigma) PHA Blastları yapmak için hücreler ilave edilmiştir. Hücreler %5 CO₂’de 37°C’de 35-mm’lik kültür kutuları içinde inkübe edilmiştir.

 2.2 Deneysel kurulum

    Tedavilerin esnekliğini göstermek için uçuk çalışmalarında tedavi yararı gösterilmiş olan bir dizi çoklu maruziyet protokolü bu çalışma için uyarlanmıştır. Beş protokolün kurulumları aşağıdaki gibidir:

1. PHA Blastları harmanlandıktan sonra 3,4 ve 5. gülerde kızılötesi (infrared) ışık kaynağı IR1072’ye maruz bırakılmıştır. 35-mm’lik kültür kutuları kullanılarak bütün hücreler 3 dakikalık kızılötesi uygulamaya maruz bırakılmıştır. Günlük tedavileri takiben individüel replike hücre örneklerinde 5. Günde canlı kalan hücre yüzdesi analiz edilmiştir.
2. PHA Blastları 5x3 dakikalık uygulama için 3. ve 5. günlerde IR1072’ye ve IR880’e maruz bırakılmış ve 5. Günde analiz edilmiştir. Hücre canlılığı ve iNOS ekspresyonu her tedaviden sonra 5. Günde belirlenmiştir.
3. PHA Blastları 1. Günden itibaren tek bir 3 dakikalık IR1072 ve IR880 dozuna maruz bırakılmıştır. Günlük irradyasyondan sonra hücrelerdeki canlılık yüzdesi analiz edilmiştir.
4. PHA Blastları 3. Günde 4x3 dakikalık ve 4. Günde tek bir 3 dakikalık IR1072 uygulamasına maruz bırakılmıştır. Hücreler daha sonra 40 dakikalık UVA maruziyetinden önce 4 saat bekletilmiş ve sonra hücre canlılığı belirlenmiştir.
5. Hücreler 3. Güne kadar doku kültürü tüplerinde inkübe edilmiş ve 3. Günde değişik dalga boylarına 2x3 dakika maruz bırakılmıştır. Dalga boyları IR660, IR880, IR950, IR1267, IR1072, IR1072 nm ile dönüşümlü olarak IR1268, IR1072 ve IR1267 nm, 1-ms pulse IR1072 nm ve 7 ms pulse IR1072 dalga boylarını içermektedir. Hücreler irradyasyondan hemen sonra canlılık yüzdesi için analiz edilmiştir.

 Kullanılan bütün protokollerde kutuların sıcaklığının IR ve kontrol uygulamaları boyunca oda sıcaklığında tutulduğu belirtilmelidir.

 2.3. Annexin V apoptoz kiti

   Hücre canlılıkları Annexin V Apoptoz Saptama Kiti (Autogen Bioclear, İngiltere) kullanılarak analiz edilmiştir. Apoptoz hücre membranında fosfatidilserin (PS) konumundaki değişiklik tarafından saptanabilmektedir. Apoptotik olmayan hücrelerde, çoğun PS molekülü plazma membranının iç tabakasında lokalizedir ama apoptozdan hemen sonra RD membranın dış tabakasına dağılmaktadır. Açığa çıktan PS Annexin V tarafından kolayca saptanabilmektedir. Annexin V ile bağlanmış olan hücreler plazma membranında yeşil renkte boyanmış olarak görülmektedir. Membran bütünlüğünü yitirmiş olan hücrelerin sitoplazması kırmızı renkte boyanmakta (PI) ve hücre yüzeyinde (plazma membranı) yeşil renkli bir halo görülmektedir [23-26]. Kutu başına 1x10⁵ – 1x10⁶ hücre yıkanmış ve Tayin Bağlama Tamponunda yeniden süspansiyon hazırlanmıştır. Beş mikrolitre Annexin V ve 10 ml propidium iyodür (PI) inkübasyondan önce, oda sıcaklığında, karanlık ortamda 15-30 dakika içinde hücrelere ilave edilmiştir. Hücreler floresans mikroskopisi kullanılarak FITC ve rhodamine için ikili bir filtre seti altında gözlemlenmiş ve körlenmiş olan en az iki gözlemci tarafından sayılmıştır.

 2.4 Western blotting analizi

      Erimiş hücre peleti süspansiyonları buz üzerinde bir Dounce homojenizatörüyle homojenize edilmiştir. Hücre süspansiyonundaki protein düzeyleri Lowry Tayini kullanılarak [27] sığır albümini standardıyla belirlenmiştir. Protein düzeyleri 10 mg proteine ayarlanmış ve her bir yola yüklenmiştir. Standart elektrofozer %6 poliakrilamid jel kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Elektroforezi takiben protein 2.5 saat 50 V nitroselüloz (NC) membrana aktarılmıştır. NC membranı 1 saat süreyle oda sıcaklığında %0.2 Tween 20 (Sigma, İngiltere) içeren 1 x Tris tamponlu tuzlu suda (TBS) %5’lik yağsız süt içinde bloke edilmiştir. NC membranı 4°C’de bir gece primer antikor iNOS ile inkübe edilmiştir. NC membranı  yıkama tamponuyla (TBS içinde %2.5 yağsız süt, %0.2 Tween 20) 4 x 10 dakika yıkanmış ve anti-tavşan yabanturpu peroksidaza bağlı sekonder antikorla (dilüsyon 1:2000) 1 saat inkübe edilmiştir. NC membranı yıkama tamponuyla 4 x 10 dakika yıkanmıştır. NC protein bantları 68 mM luminol, 1.25 mM p-kuramik asit, %30 hidrojen peroksit substratı kullanılarak vizüalize edilmiştir. İmmünoblot 3 dakika süreyle bir film kaseti içinde Hyperfilm™’e maruz bırakılmış ve oda sıcaklığında develope ve fiske edilmiştir. Protein bantları filmin lineer kenarında  bir ImageQuant® dansitometresi kullanılarak kantitatif tayin yapılmış ve relatif iNOS ekspresyonu belirlenmiştir. Optik dansite değerleri ([27]’deki gibi b-aktinle standardize edilmiştir) p<0.05’lik bir anlamlılık düzeyi ile multipl ANOVA kullanılarak karşılaştırılmıştır. Veriler n=3 individüel replike deneylerden elde edilmiştir.

 2.5 İstatistik

  Apoptoz hücre canlılığı yüzdesi kullanılarak ölçülmüştür. Bunun tanımı aşağıdaki gibidir:

% hücre canlılığı = [(canlı hücre sayısı / (toplam hücre sayısı)]*100.

 Veriler ortalama±standart sapma olarak verilmiştir.

    Kontroller ve uygulama yapılan hücreler arasındaki karşılaştırmalar multipl ANOVA kullanılarak yapılmış ve %95’lik güven aralığıyla ortalama±SD şeklinde ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz Prism 3.2 kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

 2.6 Işık kaynakları

 Hem 880 nm ve hem de 1072 nm ışık kaynakları bant genişliği 50 nm’den küçük olan  5 mW/cm² sürekli optik gücünde multimodal ışık yayan ışık kaynaklarıdır.

3. Bulgular

Bir dizi protokol kullanılarak, IR1072 uygulaması tutarlı bir şekilde PHA Blast sağkalımı üzerinde anlamlı bir protektif etki yapmıştır. Buna karşılık IR880, kontrol ve IR1072 uygulanmış hücreler karşılaştırıldığında tutarlı biçimde sitotoksik etkilidir.

  IR1072 ile irradyasyonu takiben, canlı hücre yüzdesi, 3. ve 5. günlerde 5 x 3 dakikalık tek ve çoğul tedavi protokolünden sonra kontrol verileriyle karşılaştırıldığında 5. Günde anlamlı ölçüde artmıştır (p < 0.05) (Şek. 2). Sonraki protokolde, hücreler 5 x 3 dakika süreyle IR1072 ve IR880 ile ışınlandığında, IR1072 ile karşılaştırıldığında 5. Günde  IR880 ile canlı hücre yüzdesinde anlamlı bir azalma olmuştur (p < 0.01) (Şek. 2). Günlük tedavi protokolüyle, 8 günlük dönemde, paralel deneylerde IR1072 ile karşılaştırıldığında IR880 uygulanan hücrelerde canlı hücre sayısıda anlamlı bir azalmaya neden olmuştur [Gün 1 (p < 0.01), Gün 3 (p < 0.01), Gün 4 (p < 0.05), Gün 5 (p < 0.05) ve Gün 8 (p < 0.05)] (Şek. 3). Önceden IR1072 uygulandığında ve hücreler daha sonra UVA’ya maruz bırakıldıklarında ise canlı hücre yüzdesi, tek başına UVA uygulamasına göre anlamlı ölçüde yüksek kalmıştır (p < 0.01) (Şek. 4). Çeşitli dalga bantlarıyla irradyasyondan sonra, yine IR880’e maruz bırakılan hücrelerde canlı hücre yüzdesinde anlamlı azalma görülürken (p < 0.01) uygulama yapılmayan kontrollerle karşılaştırıldığında IR1072 uygulamasını (p < 0.01)  ve alternatif  IR1072/IR1268  dalga bandını (p < 0.01),  takiben canlı hücre yüzdesi daha yüksek olmuştur  (Şek. 5). Test edilen bütün diğer dalga boyları ve koşulların hücre canlılığı üzerinde anlamlı bir etkisi olmamıştır

IR1072 maruziyetiyle gözlemlenen uzun süreli sitoproteksiyonun altında yatan potansiyel mekanizmayı açıklığa kavuşturmak için, kontrol ve IR880 nm ile karşılaştırmalı olarak iNOS ekspresyonunu araştıran kantitatif immunoblotting gerçekleştirilmiştir. Önceden IR1072 uygulamasını takiben kontrolle karşılaştırıldığında 5. Günde iNOS immünoreaktivitesinde 4.9 ± 2.1 kat olan anlamlı  (p < 0.05) bir artış saptanmıştır. Buna karşılık, paralel çalışmalarda IR880 ile iNOS’da anlamlı bir artış gözlemlenmemiştir (2.1 ± 2.2 kat,  5. Gün) (p > 0.05), (Şek. 6).

 4. Tartışma

Bu çalışma bağışıklık hücresi canlılığının olumsuz etkilerin varlığında artırılabileceği bir ex vivo yöntemi belirlemiştir. Bu örnekte, olumsuz olaylar insan vücudu dışından kaynaklanan stres ve ikinci olarak da UVA ışınlarından kaynaklanan hasardır. Birçok yazar belirli bir dalga boyunun tedavi yararı olduğu kavramını ortaya atmıştır [6–8,10,28–30]. Biyostimülasyon tedavi etkinliğinin en sık arandığı yöntemdir. 855–905 nm dalga boyları fibroblast proliferatisyonun [9] önemli ölçüde stimüle edebilirken bu aralıktaki ışığın lenfotoksik olduğu çalışmalarda gösterilmiştir. Kızılötesi ışığa maruziyetten sonra 2 saat içinde yapılan analizde hücrelerdeki sitotoksik ve protektif etkiler hızlıdır ve uygulamadan sonra en az 2 gün gözlemlenen uzun süreli etkilerdir. Bu çalışma 1050–1100 nm aralığındaki ışığın tek ve çoğul uygulama protokollerini takiben hücre canlılığını artırdığını açıkça göstermektedir. Olumsuz faktörlerin varlığında lenfosit canlılığının sürdürülnmesi anlamlıdır çünkü bakteriyel endo- ve ekzo-toksinler lökotoksik faktörlerdir ve bunların etkileri, inflamatuar hücrelerin 1072 ± 25-nm dalga boyundaki ışıkla irradyasyonla azaltılabilir. IR ışığın UVA’ya karşı koruyucu bir etkisi olduğu uzun süredir kabul edilmektedir ama dalga boylarının kesin uzunluğu bilinmemektedir. Bu mevcut sonuçlar 1072 ± 25-nm dalga boyundaki ışığın UVA’nın bazı zararlı etkilerine karşı koruyucu olduğunu düşündürmektedir. Bu, söz konusu dalga boyunun klinikte uçuk tedavisinde kullanılmasıyla (örn., [11] yayınlanmamış klinik gözlemler) uyuşmaktadır. Anlamlı olsa da korunma tam değildir ve bu nedenle daha fazla optimize edilmesi gerekmektedir. Bu ex vivo modelde, in vivo doğal olarak  mevcut başka hücre tipleri ve mediatörler dahil olmak üzere eksik unsurlar olabilir. İmmün yanıtın fotomodülasyonu tam olarak değerlendirilmesi gereken potansiyel bir tedavi aracıdır. 1072- nm dalgaboyundaki ışığın koruyucu etkisi,, potansiyel olarak psoriyazis tedavisinde PUVA ile indüklenen UV deri hasarını azaltabilir. Daha yetenekli lenfositlere yanıt veren başka patolojiler için ilave tedavi yararı söz konusu olabilir.

Nitrik oksidin çeşitli hücre tiplerinde güçlü bir apoptoz inhibitörü olduğu gösterilmiştir [31]. NO sudan ve hücre membranlarınan çok hızlı difüzyona uğramakta olup eNOS ve nNOS’a göre iNOS daha hızlı ve etkin bir şekilde üretilmektedir. iNOS hücreiçi kalsiyum düzeyleri yükseltilmeden işlev görebilmekte olup aktivitesi bağışıklık hücrelerinde örneğin primer aktive monositlerde ve makrofajlarda sitokinlere ve mikrobiyal ürünlere maruz kalınmasını takiben hızla indüklenebilmektedir [32]. Biyokimyasal olarak bu mevcut sonuçlar, uygulama yapılmayan kontrollerle karşılaştırıldığında  iNOS’un dalga boyuna bağımlı bir tarzda yukarı regüle olduğunu göstermiştir. NO’nun iki ayrı mekanizmayla bir apoptoz inhibitörü olarak etki gösterdiğine inanılmaktadır: birincisi NO’nun ya kaspaz-3-benzeri proteaz aktivasyonu düzeyinde ya da bu olayın proteaz aktivasyonunu önleyecek şekilde yukarı akımı; ikincisi NO’nun aynı zamanda kaspaz-3-benzeri proteazı enzimin S-nitrozilasyonuyla inhibe etmesi. Kaspaz-3-benzeri aktivitenin süpresyonu, hücreyi, programlanmış hücre ölümünden kurtarmaktadır [1].

Biz IR1072 ve IR880’in ex vivo olarak lenfosit canlılığı üzerinde karşıt etkilere neden olduğuna ilişkin ilk kanıtları bildirmekteyiz. IR1072 koruyucu iken IR880 dalga boyu sitotoksik etki göstermektedir. İlaveten, biz IR1072’nin UV aracılıklı lenfotoksisiteye karşı koruyucu olduğunu ilk defa göstedik.

Öncel biyokimyasal kanıtlar  iNOS’un dalga boyuna bağımlı indüksiyonunun bağışıklık hücrelerinde IR1072 ile indüklenen uzun dönemli önkoşullandırmanın altta yatan bir koruyucu mekanizma adayı olabileceğini ve daha fazla araştırılması gerektiğini göstermektedir.